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支原體qPCR檢測試劑盒的操作步驟

更新時間:2022-03-14  |  點擊率:819

支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。細胞培養工作中,主要從以下幾個方面來預防支原體的污染:控制環境污染;嚴格實驗操作;細胞培養和器材要保證無菌;在細胞培養中加入適量的抗生素。

如果受到支原體污染時,細胞形態較之無明顯變化,極易被忽視,往往直到污染非常嚴重時才能發現。受污染的細胞膜上可能有幾百個支原體,這些支原體競爭營養并釋放有毒的代謝產物,嚴重影響實驗結果。

『支原體qPCR檢測試劑盒』介紹

德國MB公司生產的支原體qPCR檢測試劑盒(均為探針法檢測),依據操作步驟的細微差別,

分『經典法』和『一步法』兩種。

此兩類試劑盒較其他廠家同類產品,具有以下*的優點:

①經典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性,一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種(涵蓋歐洲藥典規定的9種支原體),根據序列一致性,至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單,易于觀察。

(使用MB的試劑盒,下表中列出的支原體物種均為陽性,其他微生物或真核細胞均為陰性,無交叉反應)

 

 

第1步:樣本處理

a.細胞培養上清

 

 

 

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明:①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細胞培養物樣本含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原DNA,影響檢測靈敏度。

建議:樣本做DNA抽提處理,實現高靈敏度。

推薦:Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經過廣泛驗證。

第2步:試劑制備

a. 凍干粉溶解

 

b. 反應體系制備

b1) 樣品為細胞上清篩查——反應體系制備

 

b2) 樣品為生物藥——反應體系制備

 

第3步:啟動熒光定量PCR儀

 

第4步:結果判別

FAM通道:檢測支原體熒光信號。HEX通道:檢測內控對照熒光信號。

支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。

支原體DNA越多,FAM通道信號越高,檢測內控對照的HEX通道信號越低。

定量需基于Ct值和DNA標準曲線。

Ct<40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。

 

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